Рекомбинантная  Сu,Zn-супероксиддисмутаза человека. Синтез, выделение и очистка, молекулярные свойства 

 

aktivnii_centr



   СОД  — металлопротеин, состоящий из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит по одному иону меди и цинка, по Номенклатуре ферментов относится к классу оксидоредуктаз ( КФ1.15.1.1).

Этот фермент защищает клетки от интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода, являясь «перехватчиком» супероксидных радикалов (O2.-).

reakcia_vosstanovlenia_kisloroda

 Сu,Zn-СОД имеет несколько синонимов названия: эритрокупреин, гемокупреин, гепатокупреин, цереброкупреин. Общим для этих белков является присутствие меди, придающей концентрированным белковым  растворам изумрудный цвет, а различия в названиях обусловлены в первую очередь, источником происхождения фермента.

jidkaia_sod

Впервые Сu,Zn –супероксиддисмутаза была выделена из эритроцитов и печени быка в 1939 г. и получила название гемокупреин. В дальнейшем фермент выделяли из печени и мозга лошади, эритроцитов крови человека и т.д. В настоящее время большое внимание  уделяется созданию высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, синтезирующих СОД человека. Дрожжи, в отличие от бактерий, являются более подходящим, если не наилучшим реципиентом для экспрессии гена человеческой СОД, так как дрожжевая клетка обеспечивает N-концевое ацетилирование целевого белкового продукта.

Кроме общебиологического значения данного фермента, связанного с основополагающей ролью эндогенного антиоксиданта, пристальное внимание к данному белку привлечено в связи с его высокой лекарственной эффективностью. СОД воздействует на ключевые этапы заболеваний различной природы (вирусные и бактериальные инфекции, аутоиммунные заболевания, болезни ЦНС, радиационные поражения и др.), что определяет перспективность применения препаратов на основе СОД в ревматологии, кардиологии, офтальмологии, гастроэнтерологии и т.д.

СОД является эндогенным акцептором свободных кислородных радикалов, избыточное накопление которых в клетке имеет значение в развитии целого ряда кислород зависимых патологических процессов (гипоксия, воспаление, интоксикация и др.) СОД удаляет супероксидные радикалы и предотвращает образование других, более опасных для организма свободных радикалов: гидроксильного радикала и синглетного кислорода. Кроме того, СОД предотвращает накопление в очаге воспаления нейтрофилов, которые секретируют значительные количества лизосомальных ферментов, разрушающих близлежащие ткани. Очевидно, что лекарственные препараты на основе СОД являются наиболее перспективными среди противовоспалительных препаратов.

К настоящему времени существует хорошо обоснованная стратегия применения препаратов СОД при самых различных заболеваниях. Следует подчеркнуть, что лечение этих заболеваний препаратами СОД является патогенетической функциональной терапией, действующей на наиболее важное звено патологического процесса, что и отличает этот вид терапии от широко использующихся схем противовоспалительного лечения. Быстро развивается рынок лекарственных препаратов, содержащих СОД. К наиболее известным следует отнести препарат Пероксинорм (Германия) и его аналоги – препараты Онтосеин (Испания) и Палосеин (Франция),  содержащие СОД из печени крупного рогатого скота. Недавно появился отечественный препарат Эрисод, активным компонентом которого является СОД из эритроцитов крови человека.

Однако, наличие большого числа  аллергических реакций, связанных с применением препаратов на основе бычьей СОД, а также потенциальная опасность, так или иначе присущая препаратам крови человека, ограничили  терапевтическое применение как тех, так и других. Очевидно, что клиническую актуальность применения препаратов на основе СОД можно связывать с гомологичным белком, причем приоритетное направление имеют лекарственные препараты на основе рекомбинантных белков человека.

Супероксиддисмутаза человека, получаемая по генно-инженерной технологии, с использованием в качестве продуцента культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамм Y2134 отвечает вышеуказанным требованиям и может быть использована для разработки лекарственных препаратов не только для местного, но и интравазального введения.


 Выделения и очистка супероксиддисмутазы из биомассы дрожжей.

Разработана и запатентована [1] технология выделения и очистки рекомбинантной  СОД человека  из биомассы дрожжевого штамма-продуцента с применением ионообменной хроматографии. Штамм Saccharomyces cerevisiae  - продуцент СОД человека депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером  Y2134 и запатентован [2].

 

 

Молекулярные свойства рекомбинантной Cu,Zn-СОД

Сu,Zn-СОД человека имеет молекулярную массу 39 000 Да и состоит из двух субъединиц соединенных дисульфидной связью:  

Трехмерная_структура_молекулы_СОД

Трехмерная структура молекулы СОД

 Каждая субъединица содержит 151 аминокислотный остаток: 

Аминокислотная_последовательность_СОД

Аминокислотная последовательность СОД

Пространственная_организация_активного_центра_CuZn-СОД

Пространственная организация активного центра CuZn-СОД

Считается, что цинк играет структурную и стабилизирующую роль, в то время как ион меди непосредственно вовлечен в катализ. Каталитическая функция Cu,Zn-СОД – реакция диспропорционирования супероксидного анион-радикала с образованием перекиси водорода и молекулярнрго кислорода. Процесс двухступенчатый, термодинамически обусловлен и связан с циклическим восстановлением и окислением меди в активном центре. Константа скорости реакции составляет 2*109 М-1 с-1, что близко к величине константы скорости реакций, ограниченных диффузионным пределом.

 ECu2+ + O2.-  + H+à HECu+ + O2

HECu+ + O2.-  + H+à EСu2+ + H2O2

 Для доказательства идентичности полученного рекомбинантного белка и природной Cu,Zn-СОД были проведены следующие исследования: высокоэффективная хроматография высокого давления (ВЭЖХ), аминокислотный анализ,  изоэлектрофокусирование (ИЭФ), электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-ЭФ), определена ферментативная активность. Для сравнения использовали с препарат Эрисод (Образец 1), и  Cu,Zn-СОД человека фирмы Sigma (Образец 2). Рекомбинантная СОД  человека- Образец 3

На нижеследующих рисунках представлены хроматограммы образцов СОД человека и графическое определение молекулярной массы белков. Время удерживания всех трех белков одинаково, расчетные величины молекулярных масс составили 39000Да:

Высокоэффективная_жидкостная_хроматография Высокоэффективная_жидкостная_хроматография

Высокоэффективная_жидкостная_хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография образцов СОД .
а) – «Образец 3»- рекомбинантная СОД человека
в)- «Образец 1»- препарат Эрисод
с)- «Образец 2»- Cu,Zn-СОД человека фирмы «Sigma
Хроматограф Hewlett Packard HP 1050;
Неподвижная фаза TSK 2000;
Элюент 0,05 М фосфатный буферный раствор с 0,2 М аммония сульфатом рН 6,0;
Скорость 0,5мл/мин;
УФ-детектор, 280 нм.

 

Определение_молекулярной_массы_образцов_СОД

Определение молекулярной массы образцов СОД человека .
1-4 – маркерные белки: овальбумин (45000), химотрипсиноген (25000), миоглобин (17800), цитохром (12300), соответственно.
а) –Образец 3;- рекомбинантная СОД человека
в) – Образец 1 ;- препарат Эрисод
с) – Образец 2 — Cu,Zn-СОД человека фирмы Sigma

Проверка на идентичность аминокислотного состава проводилась с помощью методики аминокислотного анализа с предколоночной модификацией аминокислот. Данные представлены в Таблице:

 Определение аминокислотного состава образцов СОД человека

Определение_аминокислотного_состава_образцов_СОД_человека


Как следует  из таблицы  аминокислотный состав исследуемых препаратов  СОД в пределах погрешностей измерений совпадает.

Изоэлектрическая точка (ИЭТ) белка является достаточно специфичным и характерным его признаком. Для определения ИЭТ был использован метод изоэлектрофокусирования (ИЭФ). Результаты анализа представлены на рисунке:

Изоэлектрофокусирование_ образцов_СОД

Изоэлектрофокусирование образцов СОД
1 – Образец 3- рекомбинантная СОД человека
2 — Образец 1 — препарат Эрисод
3 — Образец 2 — Cu,Zn-СОД человека фирмы Sigma
4 – белки-маркеры изоэлектрической точки, интервал рН 3-7.

Величины ИЭТ исследуемых образцов  СОД  близки между собой  и равны 4,8±0,1.

Одним из наиболее показательных методов анализа идентичности белков является электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ). Проведение электрофореза белка в восстановленных и в невосстановленных условиях позволяет определить его кажущуюся молекулярную массу, а также наличие примесей. На рисунке показаны электрофореграммы исследуемых препаратов:

Электрофореграммы_образцов_СОД_человека

Электрофореграммы образцов СОД человека
Дорожки:
1-3 – с β-меркаптоэтанолом;
5-7 — без β-меркаптоэтанола
1,5 –Образец 3;- рекомбинантная СОД человека
2,6 — Образец 1 — препарат Эрисод
3,7 — Образец 2 — Cu,Zn-СОД человека фирмы Sigma
4 – белки-маркеры
Гель градиентный 4-20% Т; 2,7%; толщина геля 0,75 мм

Как видно из рисунка, все образцы были гомогенны как в восстановленных, так и в невосстановленных условиях. Они характеризовалась молекулярными массами в (восстановленных условиях) около 20 кДа, что соответствует молекулярному весу субъединицы фермента. Можно отметить, что в невосстановленных условиях СОД концентрируется в области 60кДа. Это связано с неспецифическим взаимодействием димерной молекулы с додецилсульфатом натрия, используемым в ПААГ. Это особенность поведения фермента в ПААГ отмечена  в литературе.

Содержание ДНК-примесей было определено методом молекулярной гибридизации. По данным анализа содержание ДНК-примесей в расчете на 1 мг высокоочищенной рекомбинантной СОД человека не превышает 2,5 пг.

 

Обратите внимание!

  • Благодаря наличию высокопродуктивного штамма дрожжей и оригинальной технологии выделения и очистки   фермента, объем производства целевого продукта может достигать десятков килограмм в год

  • Сu,Zn-СОД,  полученная генно-инженерным способом, на основе плазмидной ДНК культуры дрожжей Saccharomices cerevisiae, полностью идентична собственной Cu,Zn-СОД человека

 

 

Наши Патенты:

[1]. Соловьева Л.Я., Чурилова И.В., Княжев В.А., Калошин В.Г Способ выделения супероксиддисмутазы. Патент РФ на изобретение № 2186848, 10августа 2002.

[2]. Козлов Д.Г., Ефремов Б.Д, Ломакин И.Г., Шаронов Б.П., Чурилова И.В., Зацепин С.С. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae – продуцент СОД человека. Патент РФ на изобретение № 2044771, 27 сентября 1995

 

 

Вы можете оставить комментарий, или ссылку на Ваш сайт.

Оставить комментарий к записи REMONTPa

Темы для WP, просто Drupal, CMF WordPress русский.
Сайт размещается на хостинге Спринтхост